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    參與PCR反應的五種主要物質分別是哪些?

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      PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的的技術,通過多個循環的變性、退火和延伸,能夠使微量的遺傳物質在幾小時內得到幾百萬倍的擴增。參與PCR反應的物質主要為五種:引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

    1.引物

    引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設計有3條基本原則:首先引物與模板的序列要緊密互補,其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構,再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

    引物的選擇將決定PCR產物的大小、位置、以及擴增區域的Tm值這個和擴增物產量有關的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生,甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量:若使用設計粗糙的引物,產物將很少甚至沒有;而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數期的產量理論值。當然,即使有了好的引物,依然需要進行反應條件的優化,比如調整Mg2+濃度,使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功,但遵循某些原則,則有助于引物的設計。

    (1)引物長度

    PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為15-30bp,常用的是18~27bp,但不應大于38bp。引物過短時會造成Tm值過低,在酶反應溫度時不能與模板很好的配對;引物過長時又會造成Tm值過高,超過酶反應的*適溫度,還會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進行反應,而且合成長引物還會大大增加合成費用。

    (2)引物堿基構成

    引物的G+C含量以40~60%為宜,過高或過低都不利于引發反應,上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,有效啟動溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值*好接近72℃以使復性條件*佳。引物中四種堿基的分布*好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C,因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。

    (3)引物二級結構

    引物二級結構包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體,應控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三個連續的堿基互補,因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩定結構的可能性,引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發卡結構,也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大;影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外,與莖環結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發卡結構的引物。

    (4)引物3’端序列

    引物3’末端和模板的堿基*配對對于獲得好的結果是非常重要的,而引物3’末端*后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多,通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果,反應幾乎注定要失敗。

    引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補,尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現,這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態,從而影響擴增成功。

    引物3’末端的穩定性由引物3’末端的堿基組成決定,一般考慮末端5個堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性,此值的大小對擴增有較大的影響。應當選用3’端?G值較低(**值不超過9),負值大,則3’末端穩定性高,擴增效率更高。引物的3’端的?G值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。

    需要注意的是,如擴增編碼區域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發生簡并,會影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基,因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。

    (5)引物的5′端

    引物的5′端限定著PCR產物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點;標記生物素、熒光、Eu3+等;引入蛋白質結合DNA序列;引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩個酶切位點,應在后續方案設計完畢后確定,便于后期的克隆實驗,特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。

    (6)引物的特異性

    引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源,特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。

    2.酶及其濃度

    Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶,是從水生棲熱菌(Thermus aquaticus)中分離的。Taq DNA聚合酶是一個單亞基,分子量為94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力,5’-->3’的外切核酸酶活力,無3’-->5’的外切核酸酶活力,會在3’末端不依賴模板加入1個脫氧核苷酸(通常為A,故PCR產物克隆中有與之匹配的T載體),在體外實驗中,Taq DNA聚合酶的出錯率為10-4~10-5。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

    此酶具有以下特點:

    (1)耐高溫,在70℃下反應2小時后其殘留活性在90%以上,在93℃下反應2小時后其殘留活性是仍能保持60%,而在95℃下反應2小時后為原來的40%。

    (2)在熱變性時不會被鈍化,故不必在擴增反應的每輪循環完成后再加新酶。

    (3)一般擴增的PCR產物長度可達2.0 kb,且特異性也較高。

    PCR的廣泛應用得益于此酶,目前各試劑公司中開發了多種類型的Taq酶,有用于長片段擴增的酶,擴增長度可達40kb;有在常溫條件下即可應用的常溫PCR聚合酶;還有針對不同實驗對象的酶等。

    一典型的PCR反應約需的酶量為2.5u(總反應體積為50ml時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。

    3.dNTP的質量與濃度

    dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調節到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200mmol/l,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。

    4.模板(靶基因)核酸

    模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質結合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑(酚與氯仿抽)抽提除去蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸,該核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。

    模板DNA投入量對于細菌基因組DNA一般在1~10ng/l,實驗中模板濃度常常需要優化,一般可選擇幾個濃度梯度(濃度差以10倍為一個梯度)。在PCR反應中,過高的模板投入量往往會導致PCR實驗的失敗。

    5.Mg2+濃度
    Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200mmol/l時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應的緩沖液,而Mg2+也已添加,如果特殊實驗應采用無Mg2+的緩沖液,,在PCR反應體系中添加一定量的Mg2+。






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